菌種鑒定報告

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1 材料與方法

1.1 材料

Taq酶 EP0402 Fermentas

DNA片段膠回收試劑盒AP-GX-50 Axygen

pGEM-T 貨號A3600 Promega

LB培養基   購于上海生工

氨卡青霉素鈉   購于上海生工

1.2 主要儀器

PCR儀器   ABI 9700型PCR儀

電泳儀    BioRad

高速離心機  Thermo

高壓滅菌鍋   SANYO全自動高壓滅菌鍋

移液器     Thermo

1.3 方法

1.3.1 菌落PCR

使用27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1497R：GGTTACCTTGTTACGACTT 進行擴增，引物為南京金斯瑞生物科技有限公司合成，儲存濃度為100μm，使用濃度為10μm。按照如下方法混合各種PCR反應溶液：Buffer(Kcl) 2.5μl, 2mMdNTPs 2.5μl，27F 2μl , 1497R 2μl, 25Mm MgCl₂ 1.5μl, Taq 0.5μl, ddH₂O 14μl. 混合后用10μl的吸頭撰取菌液在混和液中攪動一下，然后進行PCR。

PCR反應參數如下：94℃ 4min; 94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 2min，30循環; 72℃ 10min。PCR結束后，1%瓊脂糖鑒定，并使用Axygen AP-GX-50 DNA片段膠回收試劑盒回收PCR片段。

 

1.3.2 T載體連接

用T載體連接PCR回收片段，按照如下混合：

2×Rapid Buffer 5μl, T載體 1μl, 片段 3μl, T4 DNA Ligase 1μl. 混合后室溫1小時。

1.3.3 轉化

取100μl的JM109感受態細胞，冰上解凍，取10μl的連接產物混入，冰上靜置30min，然后42℃熱擊90s，迅速放入冰山靜置5min，加入LB培養基，37℃ 150rpm 培養1小時，然后涂布于LA（含50μg/mL的氨卡青霉素鈉），37度培養過夜，第二天菌落PCR鑒定陽性克隆。

1.3.4 陽性克隆鑒定

分別挑取一定數量的克隆，采用菌落PCR方法進行PCR鑒定（方法見1.3.1），同時用LA培養基培養每個克隆。鑒定結果用1%的瓊脂糖鑒定，取能PCR出陽性片段的克隆送測序

1.3.5 測序比對

     使用網絡服務器http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中的Blastn進行比對。

2 結果