His標簽純化介質產品說明書
Ni Bestarose 6Fast Flow
Ni Bestarose High Performance
1、簡介
瓊脂糖親和介質（Ni）是將金屬離子Ni2+螯合在瓊脂糖凝膠上形成的一種親和層析介質，具有吸附容量大、選擇型好、易于再生、成本低等優點，廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質及多肽的分離純化，尤其是組氨酸標記蛋白質的高效純化。
2、介質性質
● 瓊脂糖濃度
6%
● 介質平均顆粒
34μm ( Ni Bestarose High
Performance) 和90μm（Ni
Bestarose 6 Fast Flow）
● 功能基團
Ni2+
● 結合載量
約40mg His標簽蛋白/ml介質
● 建議pH范圍
3-12（工作），2-14（短期）
● 推薦流速
150cm/h（最大）
● 化學穩定性
40
℃放置一周：0.01M HCl，0.1M NaOH；
12h：1M NaOH，70%乙酸；
● 存放條件
4-30℃
● 運輸與儲存溶液
20%乙醇
3、建議實驗條件
3.1 結合、清洗緩沖液的選擇
適用于His標簽純化過程的緩沖液首選磷酸鹽緩沖液，pH范圍在中性（7-8之間），避免適用EDTA及檸檬酸鹽。
結合緩沖液需要含有低濃度的咪唑，這可以減少宿主蛋白同介質的非特異結合，同時樣品中也要加入相同濃度的咪唑。
清洗緩沖液中含盡可能高的咪唑濃度可以增加重組histidine-tagged蛋白的純度，但是該濃度條件下，不能把histidine-tagged蛋白洗脫下來。
3.2 樣品的準備
在層析過程中，需要準備符合層析要求的樣品溶液。
樣品緩沖液應盡可能與結合緩沖液 一致。固體樣品可用結合緩沖液溶解配制；低濃度樣品溶液可用結合緩沖 透析；高濃度樣品溶液可用結合緩沖液稀釋。重組histidine-tagged蛋白以包涵體的形式表達，可以在緩沖液中加入6M鹽酸胍或8M尿素。當使用鹽酸胍或尿素時，蛋白會解折疊，在柱上或洗脫后蛋白解折疊，這取決于不同的蛋白。為了避免堵塞層析柱，樣品應經離心或微濾（0.45μm或者是0.22μm）處理。
3.3 洗脫
3.3.1 可通過提高咪唑的濃度進行洗脫。
3.3.2 可降低緩沖液的pH進行洗過，當緩沖液pH降低至4以下時，金屬離子會同介質解離從而達到洗脫目的。（如果目的蛋白對低pH敏感，建議洗脫液中加入1/10體積的1M Tris-HCl，pH9.0進行中和）
3.3.2 螯合劑EGTA和EDTA可將金屬離子同介質解離而達到洗脫目的，洗脫產物中的Ni2+可用脫鹽柱去除。介質可用0.1M NiSO4再次飽和后使用。
4、應用舉例
例一：
圖一
Ni-FF分離純化His標簽蛋白
層析柱：EzFast
1 ml
樣品：大腸桿菌BL21裂解液上清
結合緩沖液：20mM PB 0.5 M NaCl 20mM咪唑, pH 7.6
洗脫緩沖液：20mM PB 0.5 M NaCl 500mM咪唑, pH 7.6
5、穩定性
His標簽介質在所有常用緩沖液中保持穩定。若要長期保存，需要浸泡在20%乙醇中并儲藏于4-8℃條件下。
6、再生和在位清洗（CIP）
6.1 再生
6.1.1用2-5倍介質體積脫鎳緩沖液（50mM PB，300mM
NaCl，100mM EDTA,pH 8.0）過柱子；
6.1.2用5-10倍介質體積0.5M NaOH過柱，適當調整流速，保證介質與NaOH溶液接觸時間達到30min以上；
6.1.3用10倍介質體積去離子水洗柱；
6.1.4用3倍介質體積0.5M NaAC pH4.0緩沖液平衡柱子；
6.1.5用3倍介質體積0.1M NiSO4過柱；
6.1.6用3倍介質體積0.5M NaAC pH4.0緩沖液洗柱；
6.1.7用5倍介質體積平衡緩沖液平衡柱子。
6.2 在位清洗
6.2.1除去因離子交換作用吸附的蛋白，用2-3倍柱床體積的2M NaCl溶液清洗柱子，再用平衡緩沖液清洗柱子；
6.2.2除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，用1M NaOH以100cm/h的流速清洗柱子1h；
6.2.3除去強的疏水性蛋白和脂質等，用4倍柱床體積的70%乙醇或者30%異丙醇洗柱子，再用平衡緩沖液平衡柱子。
7、儲存
His標簽純化介質保存在含有20%乙醇溶液中，4-8℃下長期保存。
